浓香型大曲贮存期微生物群落演替及代谢产物的变化机制

大曲作为糖化发酵剂，为白酒酿造提供了重要且丰富的菌系、酶系和物系，即为后续窖内酒醅发酵提供微生物，将原料降解成小分子物质的水解酶或催化酯类物质合成的酯化酶，以及白酒风味物质或其前体物。大曲生产过程通常包括1 个月左右的主发酵期和2～6 个月左右的贮存期。近年来，关于大曲主发酵期间微生物群落及功能变化机制的研究非常活跃，而贮存期大曲微生物群落结构、酶系以及风味物质变化也越来越受到关注。总之，现有研究显示贮存过程对大曲质量具有重要影响，但关于贮存期大曲微生物群落结构及代谢产物变化机制的研究鲜有报道。

四川轻化工大学生物工程学院的徐千惠，罗惠波，黄丹*等通过高通量测序解析浓香型大曲的曲心和曲皮在贮存期间发生的微生物群落结构变化，并分析糖化酶、液化酶活力的变化，利用HS-SPME-GC-MS研究挥发性代谢产物的差异，构建零模型解析微生物群落的组装过程，运用相关性分析探究糖化力、液化力、风味物质与大曲微生物之间的联系，揭示浓香型大曲贮存期菌系、酶系以及物系的变化机制，为优化大曲贮存工艺、提高大曲质量提供理论依据。

1 浓香型大曲贮存过程中微生物群落结构变化

1.1 浓香型大曲贮存过程中优势微生物群落演替特征

大曲微生物在持续进行的贮存过程中此消彼长，采用高通量测序技术对其演替情况进行解析。在大曲贮存期间共注释到16 个细菌门和4 个真菌门，212 个细菌属和30 个真菌属，其中将平均相对丰度前10的优势微生物属变化情况绘制成柱形图展示。由图1a可知，曲皮在入库贮存第0天的主要优势细菌是芽孢杆菌属（

Bacillus

Pseudomonas

Weissella

Streptococcus

Actinomyces

Kroppenstedtia

Thermoactinomyces

Staphylococcus

Lactobacillus

Enterococcus

Thermoascus

Aspergillus

Pichia

总体看来，大曲贮存过程使曲皮中的魏斯氏菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属和曲心中的高温放线菌属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、曲霉属的相对丰度得到了极大提高，同时使曲皮和曲心中的芽孢杆菌属、假单胞菌属、嗜热子囊菌属等的相对丰度下降。此外，曲皮中others的变化情况显示了大曲中一些原本的极低丰度微生物可能由于适应曲库的环境条件以及微生物之间友好的相互关系而大量生长，同时一些微生物因为适应性差而走向衰竭。这些结果都表明贮存使大曲微生物间相互作用重新平衡，改变了微生物群落组成。

1.2 浓香型大曲贮存过程中菌群结构特征的变化

不同贮存时间的大曲微生物

为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化，对大曲样品进行PCoA。由图3a可知，PC1和PC2对细菌群落组成差异的解释度分别为29.63%和22.15%，共计51.78%。贮存前43 d的曲心细菌结构相近，但曲皮细菌样本相互分离较远，说明贮存前43 d内曲皮细菌结构发生了明显变化。贮存第108、161天曲心和曲皮的细菌样本各自聚在一起，表明大曲贮存3 个月后，细菌结构已经趋于稳定，这与以往的研究一致。如图3b所示，PC1和PC2对真菌群落组成差异的解释度分别为53.02%和41.79%，总解释度高达94.81%。曲心的真菌结构总体距离相近，说明曲心真菌结构在贮存过程中变化不大，并且与贮存第0、43、161天的曲皮真菌结构相似性较高，但分别与曲皮在第9、108天的真菌结构相差甚远。为进一步了解大曲贮存期间微生物群落结构，Venn图展示了不同贮存时期间的共有微生物及特有微生物数量。如图4所示，在属水平上，曲皮、曲心在5 个贮存时期分别有13、14 个共有物种，其中绝大部分如曲霉属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属、魏斯氏菌属等都属于图1中的优势菌属，但它们在贮存不同时期的相对丰度各不相同。曲皮和曲心在每个贮存时期的特有物种数量总和分别占53%和50%，表明大曲贮存过程中的微生物差异由一半的共有物种的丰度差异和一半的特有物种的物种差异组成。这些结果同样表明一些原本的极低丰度微生物可能会随着贮存的进行大量生长，同时一些微生物丰度降至极低，也有研究显示部分特有低丰度微生物来自贮存环境。

2 浓香型大曲贮存过程中糖化力和液化力的变化

糖化酶是微生物代谢产生的重要酶类，能将酿酒原料中的淀粉、纤维素等多糖降解为还原糖，再由酵母等微生物进一步转化为乙醇，因此糖化力是大曲重要的生化指标。由图5a可知，曲皮糖化力在贮存前108 d先上升后下降（272、398、107 mg/（g·h）），在贮存第108～161天内大幅回升（107～256 mg/（g·h））。而曲心糖化力在48～187 mg/（g·h）之间呈现比较规律的波动。液化酶能断裂淀粉分子的

3 浓香型大曲贮存过程中挥发性代谢产物的变化

大曲中的风味物质可以作为酒体中香气物质的直接来源，也可作为酒中香气物质的重要前驱物来源。采用HS-SPME-GC-MS分别在贮存过程的曲心和曲皮位置检测到67、70 种挥发性化合物，可分为醇类、酯类、酚类、酸类、醛酮类、烷烯类、吡嗪类和其他物质。由图6可知，曲皮中风味物质的总含量随着贮存时间呈现先下降后上升再下降的变化趋势，其中在贮存约3 个月时总含量达到最高，这在其他报道中也有同样的发现，相比之下，曲心中的风味物质含量总体较为稳定，仅在贮存结束时发生了较大的下降。酯类物质是中国白酒中令人愉悦的水果、花香、蜂蜜香气的主要贡献者，是贮存期间占比最大的挥发性风味物质，令人注意的是其在曲皮贮存第108天时发生了激增，与前述微生物群落演替结果相结合，推测这种变化可能与魏斯氏菌和毕赤酵母的剧烈增加有关。据报道，魏斯氏菌发酵产生乳酸，为乳酸乙酯的合成提供前体物质，毕赤酵母能利用蔗糖和葡萄糖制造乙酸乙酯等芳香化合物，二者均在酯化过程中发挥重要作用。醇作为酸和酯的重要前体物质，其含量仅次于酯类，在贮存期间变化幅度不大。酸类、烷烯类、醛酮类物质的变化比较一致，表现为贮存初期有较高的含量，之后迅速下降，并在之后的贮存期间保持非常低的含量。总体上，贮存过程使风味物质总含量减少，这与Zhang Yuandi等的研究结果一致。其中醇类物质、酯类物质略微降低，酸类物质、烷烯类物质、醛酮类物质大量减少。结果表明随着贮存时间的推移，一些重要的风味化合物被丰富，一些异杂味被减少或去除，同时伴随着部分风味物质的挥发，说明贮存过程有助于“净化”风味、形成独特浓郁的“大曲味”。

4 浓香型大曲贮存过程中微生物群落的演替机制

为探究大曲贮存过程中微生物群落结构的变化原因，采用系统发育零模型计算大曲微生物群落的βNTI来判断群落的构建过程。如图7a所示，曲皮细菌群落的βNTI值在－1.12～5.05之间变化，曲心细菌在－1.28～5.55之间变化，二者的|βNTI|＞2的占比均为40%，说明细菌群落的组装过程主要受60%的随机性过程影响，同时受40%的确定性过程影响。曲皮真菌群落的βNTI值在－0.64～3.61之间波动，其|βNTI|＞2的比例为20%，说明曲皮真菌群落受随机性过程主导（80%）。而曲心真菌仅在－1.52～1.76之间波动，说明其完全受随机性过程影响（100%）。总体上，大曲贮存期间微生物群落的组装主要由随机性过程主导。相较于真菌来说，细菌受确定性过程的影响更大；相较于曲心微生物来说，曲皮微生物受确定性过程的影响更大。

为了进一步量化随机性和确定性过程在贮存期大曲微生物群落构建中的贡献程度，图7b显示了群落的修正RCbray。结果表明无论是曲皮还是曲心，对细菌群落构建的影响因素包括40%的变量选择（环境因子、微生物相互作用等）、40%的扩散限制以及20%的未定义过程（生态漂变等）。而真菌群落则大部分受未定义过程的影响（曲皮70%、曲心90%），说明主要由生态漂变等导致真菌结构发生随机变化。变量选择对曲皮真菌群落构建的贡献为30%，但对曲心真菌的贡献为0。匀质扩散只在曲心真菌群落构建过程中发挥了一定作用（10%），这种生态过程会导致群落结构的相似性。而对于细菌群落来说，相对稳定的贮存环境可能导致扩散限制较大地影响了细菌在曲库中的扩散。有研究表明，真菌群落在曲心中倾向于随机分散，而细菌群落则偏好聚集状态。结果表明，变量选择对微生物菌群（尤其是曲皮中）发挥较大的作用，说明贮存条件的改变及微生物间的相互作用对群落演替十分重要。而目前的生产中，贮存期间几乎都未采取人工调控温湿度等措施，使气候条件成了重要因素，可见在大曲贮存期实施工艺调控对稳定大曲质量具有重要意义。

大曲贮存过程中微生物的生态位宽度如图8所示。曲心细菌和曲皮真菌在贮存第108天和曲皮细菌在贮存第43天时的生态位宽度发生激增，说明这时候微生物对环境资源的利用程度大大增加，这一时期的变化与图1中优势菌群结构发生剧烈演替相符合。对比贮存前后的生态位宽度，结果显示除了曲皮细菌外，其余菌群的生态位宽度经贮存后都增加，说明贮存使大曲微生物对环境资源的利用增加，对微生物间相互作用的适应状况更好。贮存过程中不同时期的大曲微生物占据着不同的生态位，显示了对环境扰动的不同响应，这种响应是由其生理耐受性、扩散能力、分类多样性和功能多样性等共同介导，因此贮存期大曲微生物群落不同的组装过程可能是受到微生物群对环境干扰的不同响应和生态位宽度的差异所影响。此结果与零模型的分析结果一致反映了贮存环境对大曲微生物生长代谢的重要性。

5 浓香型大曲贮存过程中重要酶活力与微生物群落演替的相关性

贮存期间大曲微生物群落不断变化，并通过代谢活动引起酶活力的变化。通过RDA探究两种重要酶活力与大曲微生物间的关联，其中RDA1和RDA2（加权）标准正交物种得分大于0.09的菌属见图9。如图9a所示，曲皮中，糖化力与嗜热子囊菌属呈负相关，与毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属和曲霉属呈正相关。贮存第108天和第161天的曲皮样本与液化力极为相关，其中属毕赤酵母属、魏斯氏菌属、乳杆菌属贡献最大。由图9b可知，曲心中的糖化力和液化力均与科萨克氏菌属（

Kosakonia

Thermomyces

6 浓香型大曲贮存过程中挥发性风味物质与微生物群落演替的相关性

为探究大曲贮存期间挥发性风味物质的变化机制，利用Spearman相关性分析评估挥发性化合物与微生物的关联。如图10a所示，曲皮中一些酯类物质如9-十六碳烯酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、十八烯酸乙酯与根霉属（

Rhizopus

Wickerhamomyces

Flavobacterium

Alternaria

Corynebacterium

Fusobacterium

Acetobacter

Streptomyces

Exiguobacterium

Brachybacterium

Thermobacillus

Klebsiella

Thermus

Crossiella

结论

本研究利用高通量测序探究浓香型大曲贮存过程中的微生物群落组成及结构特征。结果显示大曲的贮存过程是微生物进一步相互作用并重新平衡群落结构的过程，长时间的贮存改变了功能微生物比例，最终导致微生物多样性增加、群落结构趋于稳定、均匀。贮存结束后，成熟大曲的曲心微生物群落主要由芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、高温放线菌属、克罗彭斯特菌属、乳杆菌属、嗜热子囊菌属、曲霉属等组成；曲皮微生物主要包括魏斯氏菌属、乳杆菌、高温放线菌属、嗜热子囊菌属、毕赤酵母属等优势微生物。此外研究了糖化力、液化力以及挥发性风味物质的变化规律，发现贮存过程使曲皮中糖化力、液化力有所下降，但在曲心中有所增加，同时有助于风味物质的丰富和转化，这些变化使曲香更加浓郁。通过构建零模型探索微生物群落的组装机制，发现随机性过程主导了群落结构的变化，同时确定性过程也有重要影响，其中变量选择发挥了较大的作用，生态位差异也有一定影响，这一结论还需更多的研究验证。多元统计分析显示微生物区系与大曲糖化力、液化力及挥发性代谢产物之间有显著相关性，说明贮存有助于通过改变微生物群落生产出高质量大曲。

总之，贮存过程对大曲微生物群落结构的重新平衡、酶活力及挥发性代谢产物的积累与转化具有重要意义，这与Fan Guangsen等的研究结果一致。引起这些变化的确定性过程是变量选择，说明大曲贮存期实施工艺调控对稳定大曲质量非常重要。此外，还应对微生物的代谢通路进行分析，进一步完善贮存期间大曲品质的变化机制。本研究对优化大曲的贮存工艺、提高大曲品质具有重要意义。

本文《浓香型大曲贮存期微生物群落演替及代谢产物的变化机制》来源于《食品科学》2023年44卷第22期225-234页，作者徐千惠，饶家权，邹永芳，张 明，罗惠波，黄 丹。